Evaluation du test MammaPrint avec la technologie target RNA sequencing

Assessment of the MammaPrint 70-gene profile using targeted RNA-sequencing technology

L Mittempergher (1), JB Spangler JB (2), MH Snel (1), LJ Delahaye (1), S Tian S (1), I Beumer (1), A Witteveen (1), B Chan (2), D Wehkamp (1), R Bernards (1,3) and AM Glas (1)

1Department of Research and Development, Agendia, Amsterdam, the Netherlands.
2Department of Product Support, Agendia, Irvine, California, US.
3Department of Molecular Carcinogenesis, The Netherlands Cancer Institute NKI-AVL, Amsterdam, the Netherlands.

MammaPrint/BluePrint/Microarray/RNASeq/Targeted RNA seq/Expression génique

MammaPrint/BluePrint/Microarray/RNASeq/Targeted RNA seq/recurrence test

Introduction
Les progrès réalisés depuis quelques années dans les procédés d’analyse de l’ARN ont rendu possible la mise en place de tests diagnostiques réalisés sur micropuce à partir de tissus fixés au formol et inclus dans de la paraffine (bloc FFPE) . C’est ainsi qu’en 2012, l’équivalence sur bloc FFPE du test MammaPrint , test de diagnostic in vitro initialement développé sur tissu frais congelé et effectué sur micropuce pour déterminer le risque de récidive du cancer du sein, a pu être démontrée [1]. Cette équivalence sur FFPE a permis de décupler l’utilisation du test en le rendant plus accessible.
.
Plus récemment, les techniques de séquençage à haut débit de l’ARN (RNA-seq) sont devenues des méthodes de référence pour analyser l’ARN compte tenue de leur grande sensibilité et de leur capacité à évaluer la dynamique des variations de niveau d’expression des gènes [2] . La technologie RNA seq peut potentiellement révolutionner le diagnostic clinique et plusieurs initiatives ont déjà été engagées pour définir des recommandations techniques et analytiques pour l’établissement de bonnes pratiques de laboratoire [3].

Objectif
Transfert du test diagnostique MammaPrint de la micropuce vers un test de Nouvelle Génération utilisant le séquençage à haut debit (targeted RNAseq).

Méthode
L'ARN total a été isolé à partir de tissu sous forme de blocs FFPE et le séquençage des ARNs a été réalisé après enrichissement ciblé de l’ARN par l’utilisation du kit « SureSelectXT» d’Agilent ciblant les 70 gènes du test MammaPrint et les 80 gènes du test BluePrint [4].
La préparation des banques a été réalisée à partir de 100ng d’ARN total quantifié par Bioanalyzer (DV200). Le séquençage a été effectué sur la plateforme Illumina Miseq en 1x150pb. Les séquences générées ont été alignées sur le génome de référence humain ((hg19 build 37) afin de quantifier le nombre de séquences obtenues sur chacun des gènes. La quantification a été normalisée en CPM (count per Million) et convertie en log2. Les échantillons ont été analysés en parallèle par le test MammaPrint sur micropuce selon le procédé d’analyse diagnostique CLIA CAP certifié et complètement validé afin de comparer les résultats.

Résultats
En moyenne, un nombre de 1.2 Mio de séquences a été généré par échantillon en groupant environ 15 échantillons par run Miseq. 96.3% des séquences ont été alignées avec succès sur les gènes d’intérêt dont 74,8% sur la région codante, ce qui est comparable aux données obtenues sur tissus frais congelés. Une excellente concordance (test de corrélation de Pearson >0.96) a été obtenue entre les résultats obtenus sur micropuce et les données de séquençage haut débit en targetted RNA seq. Il en est de même pour les résultats obtenus sur le test BluePrint avec, pour chacun des sous-types moléculaires, les valeurs suivantes : Luminal=0.95, Basal 0.93, et HER2 0.92.

Discussion
Ces premières analyses de concordance entre MammaPrint sur micropuce et MammaPrint RNA seq ont été réalisées sur une série de 85 échantillons FFPE provenant de cancer du sein au stade précoce. Des travaux complémentaires sont engagés afin de démontrer la stabilité et la reproductibilité de ces résultats.

Conclusion
Le séquençage de Nouvelle Génération de type RNA-Seq peut être utilisé pour analyser le niveau d’expression des 70 et 80 gènes d’intérêt des tests diagnostiques MammaPrint et BluePrint. La concordance établie entre les deux techniques ouvrent de nouvelles perspectives pour Agendia et rend possible la décentralisation des tests par RNA-Seq. La société pourrait ainsi proposer ses tests soit via une analyse centralisée sur l’un de ses laboratoires certifiés, soit par une analyse décentralisée des laboratoires partenaires de référence, afin de faciliter l’accès des patients en France pour un traitement plus personnalisé du cancer du sein.

Bibliographie
1. Sapino A et al. J Mol Diagn 2014
2. Conesa A et al. Genome Biol. 2016
3. Byron SA et al. Nat Reviews Genetics, 2016
4. Krijgsman O et al. BCRT 2012